"陷阱"与"叛变"：NETs如何策反巨噬细胞共建肝癌转移微环境

一、研究背景

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，常在慢性肝脏炎症（如乙/丙型肝炎病毒感染、酒精滥用或非酒精性脂肪性肝炎）背景下发生发展。肿瘤微环境（TME）中富集着多种免疫细胞，其中中性粒细胞和巨噬细胞是调控肿瘤促进性炎症和免疫逃逸的关键角色。

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是由活化中性粒细胞释放的网状结构，由DNA、组蛋白和抗菌蛋白组成。除最初发现的捕获病原体的功能外，NETs还可通过促进转移、调节免疫反应和血管生成等方式参与癌症进展。已有研究表明，NETs携带多种损伤相关分子模式（DAMPs），可差异性地调控肿瘤细胞和免疫细胞功能。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）具有显著可塑性，可分化为促炎型M1和促肿瘤型M2巨噬细胞。M2巨噬细胞又可进一步细分为M2a、M2b、M2c和M2d亚群，其中M2d亚群因高分泌IL-10、TGF-β和VEGF而备受关注，在肿瘤进展、血管生成和免疫抑制中发挥重要作用。然而，中性粒细胞与巨噬细胞在HCC微环境中的相互作用及其对疾病进展的贡献机制仍不清楚。本研究旨在阐明NETs介导的巨噬细胞重编程机制及其对肿瘤进展的影响，并探索中性粒细胞与巨噬细胞之间是否存在相互调控的反馈环路

我来详细阅读并解读这篇关于中性粒细胞-巨噬细胞串扰通过NETs-IL-17/VEGF/S100A9轴促进肝细胞癌进展的研究论文。

二、研究结果

2.1 NETs水平在HCC患者中升高，尤其在晚期和转移阶段

基于TCGA-LIHC队列（368例肿瘤样本和50例癌旁正常样本）的生物信息学分析显示，36个NETs相关基因中大多数在HCC组织中显著上调。在临床样本验证中，HCC患者肝组织中的CD66b⁺中性粒细胞浸润和CitH3（瓜氨酸化组蛋白H3，NETs特异性标志物）表达均显著高于健康对照（HC）。HCC患者外周血中性粒细胞中CitH3表达也明显升高。血清MPO-DNA（循环NETs标志物）水平在HCC患者中显著升高，且与TNM分期呈正相关，IV期患者最高。值得注意的是，伴转移的HCC患者MPO-DNA水平更高，尤其是伴肝外转移者。外周血中性粒细胞中CitH3在肝外转移患者中也显著升高。这些结果表明NETs水平与HCC进展和转移密切相关。

2.2 HCC中M2巨噬细胞富集与NETs形成密切相关

TCGA数据分析显示，M2相关基因在HCC组织中普遍上调，而M1相关基因表达模式不一致。免疫荧光染色证实HCC肿瘤中CD68⁺CD206⁺M2巨噬细胞显著增加。血清中M2d相关细胞因子TGF-β、VEGF、IL-10和CCL13在HCC患者中显著升高。进一步的相关性分析揭示NETs相关基因与M2巨噬细胞标志基因呈正相关。HCC组织中NETs水平高的区域伴随更多M2巨噬细胞浸润，且血清M2d细胞因子水平与MPO-DNA呈正相关。这些临床数据提示中性粒细胞与M2巨噬细胞在HCC肿瘤微环境中存在潜在相互作用。

2.3 NETs在HCC细胞存在时促进M2d巨噬细胞极化

体外实验首先证实NETs单独刺激不能直接诱导THP-1来源或PBMC来源的M0巨噬细胞向M1（CD68⁺CD86⁺）或M2（CD68⁺CD206⁺）极化。为模拟肿瘤微环境，建立了多细胞共培养体系：将M0巨噬细胞与正常肝细胞（THLE-2）或HCC细胞（HuH-7）共培养，同时加入或不加入NETs。结果显示，与HuH-7细胞单独共培养可适度增加M2巨噬细胞比例；加入NETs后，M2极化显著增强且呈时间依赖性。而与THLE-2共培养时NETs无此效应。M2d相关基因（VEGF、IL-10、TGF-β）的mRNA水平及蛋白分泌在NETs+HuH-7组显著上调，M1标志物iNOS和TNF-α则无显著变化。这些结果表明NETs需要在HCC细胞存在的环境下才能有效促进M2d极化。

2.4 NETs携带的IL-17激活IL-17R/NF-κB信号通路介导M2巨噬细胞极化

为探究NETs调控巨噬细胞极化的机制，对三组THP-1-M0（单独培养、与HuH-7共培养、与HuH-7+NETs共培养）进行转录组测序。KEGG分析显示，与单独培养组相比，共培养组共同富集了14条关键信号通路，其中IL-17和TNF信号通路在NETs添加组（C vs B）中尤为突出。引入IL-17R抑制剂AMG827后，NETs诱导的M2极化显著受抑，VEGF和IL-10表达下降。

进一步鉴定IL-17来源发现：HCC患者来源的NETs中IL-17蛋白水平显著高于健康对照，ELISA定量也证实NETs携带的IL-17在HCC患者中显著升高。HCC患者中性粒细胞胞内IL-17水平也显著增高。免疫荧光显示IL-17广泛沉积在HCC患者NETs上。由于NF-κB是IL-17R激活的关键下游效应分子，实验证实NETs增加巨噬细胞中NF-κB p-p65水平，而AMG827可减弱此效应。NF-κB抑制剂BAY11-7082同样可抑制NETs诱导的M2极化和M2d细胞因子分泌。综上，NETs通过携带的IL-17激活IL-17R/NF-κB信号通路促进M2d极化。

2.5 NETs诱导的M2d巨噬细胞极化加剧HCC恶性进展

为评估NETs介导的M2d对HCC恶性行为的影响，制备了四种条件培养基（CM）：CM(HuH-7/HepG2)、CM(HuH-7/HepG2+M0)、CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)和CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs+AMG827)。结果显示，各组对HCC细胞增殖和凋亡无显著影响。但CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)显著增强HUVEC管腔形成能力（血管生成），AMG 827可部分逆转此效应。

体内皮下移植瘤实验中，将Hepa1-6细胞与RAW264.7和NETs共注射可显著增加肿瘤体积和重量，PCNA（增殖标志物）、CD31和VEGF（血管生成标志物）、CD206（M2标志物）及CitH3表达均上调，而CD86（M1标志物）无变化。AMG 827可部分逆转这些效应。在DEN/CCl4诱导的自发性HCC模型中，LPS诱导NETs形成可显著促进HCC进展（增加肿瘤负荷、肝/体重比和肿瘤面积），DNase I（降解NETs）或AMG827均可部分逆转。免疫组化/免疫荧光证实NETs诱导增加M2（F4/80⁺CD206⁺）积累及Ki67、CD31、VEGF上调。这些体内外结果验证了IL-17信号在NETs诱导M2极化和促肿瘤功能中的关键作用。

2.6 NETs诱导M2d巨噬细胞极化促进HCC转移

Transwell迁移和侵袭实验显示，CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)显著增加HuH-7和HepG2细胞的迁移和侵袭能力，AMG 827处理可部分减少。机制研究发现，该条件培养基降低上皮标志物E-cadherin、增加间充质标志物N-cadherin表达，提示EMT过程被激活；同时侵袭相关蛋白MMP2和MMP9表达升高，AMG827可逆转这些分子改变。

体内肺转移模型中，尾静脉注射Hepa1-6+RAW264.7+NETs组小鼠肺组织重量、转移结节数和转移面积均显著增加，AMG827可部分抑制。这些结果一致表明NETs介导的M2d极化可促进HCC转移。

2.7 M2d巨噬细胞来源的VEGF通过间接促进HCC细胞来源的S100A9诱导NETs形成

为探究NETs诱导的M2d是否反过来调控NETs释放，将中性粒细胞暴露于不同条件培养基。CM-M0对CitH3无显著影响；CM-HuH-7可诱导CitH3上调；CM-(HuH-7+M0)进一步增强；CM-(HuH-7+M0+NETs)达到最高水平。免疫荧光检测DNA/MPO/CitH3也证实相同趋势，表明HCC细胞来源因子促进NET形成，而与NETs诱导的M2d串扰具有更强的刺激效应。

鉴于前期研究发现HCC细胞释放的S100A9促进NET形成，本研究检测发现CM-(HuH-7+M0+NETs)显著上调HuH-7细胞S100A9表达，ELISA定量也证实培养上清中S100A9升高。加入S100A9抑制剂Paquinimod后，CM-(HuH-7+M0)和CM-(HuH-7+M0+NETs)诱导的CitH3均显著下调，免疫荧光也证实NETs形成减少。进一步探索M2d调控S100A9的机制：由于NF-κB驱动S100A9表达，且M2d分泌大量VEGF可激活NF-κB，假设M2d通过VEGF-NF-κB轴诱导S100A9。VEGFR抑制剂AV-951处理显著降低HuH-7细胞中p-p65(S536)和S100A9水平。外源性VEGF刺激增加S100A9和p-p65，而NF-κB抑制剂BAY11-7082可消除这些效应。临床样本相关性分析显示：NETs-IL-17与MPO-DNA正相关；VEGF与NETs-IL-17正相关；S100A9与VEGF正相关；S100A9与MPO-DNA正相关。这些相关性数据支持NETs-IL-17→VEGF→S100A9→NETs的正反馈环路存在。

2.8 中性粒细胞来源的NETs-IL-17在HCC患者中的临床意义

按临床病理参数分层分析NETs-IL-17分布：性别、年龄、肿瘤大小和数量对NETs-IL-17水平无显著影响，提示该标志物不受这些基线变量影响。TNM I+II期与III+IV期间无显著差异（p=0.06），有无转移间也无差异。但在伴转移的病例中，肝外转移者NETs-IL-17显著高于无肝外转移者（p=0.0001）。

ROC曲线分析显示：区分早晚期HCC时，NETs、NETs-IL-17、VEGF和S100A9的AUC分别为0.61、0.65、0.51和0.54，判别能力有限。预测总体转移状态时AUC分别为0.64、0.57、0.51和0.53，表现同样一般。但预测肝外转移时，NETs和NETs-IL-17的AUC分别提升至0.80和0.89，显著优于VEGF（0.61）和S100A9（0.62）。在所有检测标志物中，NETs-IL-17对肝外转移的识别能力最强，显示出作为预测HCC肝外转移的非侵入性生物标志物的潜力。

三、研究结论

本研究揭示了HCC肿瘤微环境中中性粒细胞与巨噬细胞之间通过NETs-IL-17/VEGF/S100A9轴建立的正反馈环路，具体机制如下：

Ø NETs→M2d极化：HCC微环境中，中性粒细胞释放的NETs携带IL-17，通过激活巨噬细胞表面IL-17R及其下游NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞向促肿瘤的M2d表型极化。此过程需要HCC细胞的存在，NETs单独不能直接诱导极化。

Ø M2d→NETs形成：极化的M2d巨噬细胞分泌VEGF，通过VEGFR激活HCC细胞中NF-κB信号，上调S100A9表达。S100A9作为DAMP进一步刺激中性粒细胞释放更多NETs，完成正反馈循环。

Ø 促肿瘤效应：该正反馈环路加速HCC生长（促进血管生成）、侵袭和转移（诱导EMT、上调MMP2/9）。

Ø 临床转化价值：NETs-IL-17在预测HCC肝外转移方面具有优异的诊断效能（AUC=0.89），优于传统标志物，可作为无创生物标志物用于高风险患者的早期识别。同时，该轴的多个节点（NETs形成、IL-17R、VEGF、S100A9）均为可药物干预的靶点，为HCC的联合治疗策略提供了新思路。

Wu R, Wu R, Kong X, Wang X, Duan Y, Cao S, Yu S, Zhao Y, Li S, Zhou J, Duan L. Neutrophil-macrophage crosstalk via NETs-IL-17/VEGF/S100A9 axis promotes hepatocellular carcinoma progression. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Dec 30;45(1):27. doi: 10.1186/s13046-0.