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一、研究背景
前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，晚期患者经雄激素剥夺治疗（ADT）后常发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），临床治疗选择有限且疗效不佳。CBL0137是一种广谱抗肿瘤药物，可通过抑制FACT复合物及诱导坏死性凋亡（Necroptosis）发挥抗癌作用，但其肿瘤选择性不足和全身毒性限制了临床应用。鉴于前列腺癌细胞内谷胱甘肽（GSH）水平升高，且丁酸代谢与蛋白质赖氨酸丁酰化等翻译后修饰在肿瘤进展中的作用日益受到关注，本研究构建了一种基于半胱氨酸的GSH响应性聚合物（Cys8E）纳米递送系统，旨在实现CBL0137的靶向递送，并探索纳米载体自身是否可通过代谢重塑协同增强抗肿瘤效果。
二、研究结果
n 1. GSH响应性纳米平台的构建与表征
该研究首先通过整合单细胞RNA-seq数据分析发现，前列腺癌肿瘤来源细胞的谷胱甘肽代谢和丁酸代谢活性显著高于癌旁及正常前列腺组织，其中PC-3和DU145细胞GSH水平最高。据此，研究者合成了Cys8E聚合物并通过纳米沉淀法包载CBL0137，制备得到Cys8E@CBL NPs，其载药量和包封率分别为8.9%和46.9%，平均粒径约85 nm，分布均一且7天内稳定性良好。体外释放实验证实，该纳米粒在含10 mM GSH的还原性环境中可加速释放药物，累积释放率达约80%。细胞摄取实验显示纳米粒可被前列腺癌细胞有效内化；细胞毒性实验表明，Cys8E@CBL NPs对PC-3和DU145的IC50显著低于游离CBL0137，而对正常前列腺上皮细胞RWPE-1的毒性明显更低，表现出良好的肿瘤选择性杀伤优势。
2. Cys8E@CBL NPs增强CBL0137的细胞毒性
生物信息学分析显示，程序性坏死性细胞死亡通路在丁酸代谢评分高的前列腺癌患者中显著富集，且与不良预后相关；谷胱甘肽代谢与坏死性凋亡特征呈显著正相关。流式细胞术Annexin V/PI染色结果表明，在相同药物浓度下，Cys8E@CBL NPs较游离CBL0137诱导更多PC-3和DU145细胞死亡；坏死性凋亡抑制剂NSA预处理可部分恢复细胞活力，证实坏死性凋亡参与了该过程。EdU实验和克隆形成实验进一步表明Cys8E@CBL NPs最强地抑制了肿瘤细胞增殖和克隆生长能力；Western blot检测显示该处理组p-RIPK3和p-MLKL水平显著升高，提示纳米制剂通过激活RIPK3-MLKL信号通路增强了CBL0137诱导的坏死性凋亡。
3. Cys8E NPs在肿瘤中的有效蓄积
在PC-3异种移植瘤小鼠体内分布研究中，研究者以DiR为近红外荧光示踪剂，通过尾静脉注射比较了游离DiR与DiR@Cys8E NPs的体内行为。活体成像结果显示，游离DiR主要蓄积于肝脏，肿瘤部位荧光信号微弱且快速消退；而DiR@Cys8E NPs在肿瘤部位产生更持久且强烈的荧光信号。给药96小时后的离体器官成像进一步证实，纳米粒组肿瘤荧光强度显著高于游离DiR组，尽管肝脏仍有较强荧光（可能与肝脏清除及局部氧化还原环境有关），但整体表明Cys8E NPs具有良好的肿瘤靶向蓄积能力。
4. Cys8E@CBL NPs的体内治疗效果
在PC-3皮下移植瘤裸鼠模型中，每3天尾静脉注射Cys8E@CBL NPs可最大程度抑制肿瘤生长并降低终末肿瘤重量，其抗肿瘤效果显著优于PBS对照组、空白Cys8E NPs组和游离CBL0137组。治疗期间各组小鼠体重无显著差异，提示在测试剂量下无明显全身毒性。免疫组化分析显示，Cys8E@CBL NPs组肿瘤组织中Ki-67表达显著降低，而cleaved Caspase-3和Caspase-3染色增强；多重免疫组化（mIHC）显示该组ZBP1和RIPK3信号更强，与增强的死亡信号一致。此外，主要器官组织学检查、血清ALT/AST/BUN水平、血常规参数及溶血实验均未发现明显毒性迹象，证实了该纳米制剂良好的体内安全性（补充材料中）。
5. Cys8E NPs改变丁酸相关代谢
机制探索表明，Cys8E NPs与CBL0137联用可上调坏死性凋亡相关蛋白，同时降低细胞内GSH水平。蛋白质组学分析发现，Cys8E NPs处理后丁酸代谢通路发生显著改变，ECHS1、ACAT2和HMGCS1等关键代谢酶丰度发生变化，且丁酸代谢评分与坏死性凋亡特征呈正相关。对配对前列腺癌及癌旁非肿瘤组织的非靶向代谢组学分析也证实了谷胱甘肽代谢和丁酸代谢通路的异常。功能验证实验显示，外源性丁酸钠可增强CBL0137诱导的细胞死亡，直接支持丁酸相关代谢重塑在增强细胞毒性反应中的重要作用，提示Cys8E载体并非单纯惰性递送工具，而是主动参与了肿瘤代谢调控。
6. Cys8E NPs将丁酸相关代谢重塑与PGAM5-K95丁酰化相联系
进一步机制研究发现，ECHS1和ACAT2的表达水平与前列腺癌患者无进展生存期显著相关。Cys8E NPs处理可降低ACAT2和ECHS1蛋白丰度，放线菌酮（CHX）追踪实验证实ECHS1蛋白稳定性下降。同时，Western blot显示Cys8E NPs增加了全细胞蛋白的丁酰化水平；通过泛丁酰化抗体免疫沉淀结合LC-MS/MS分析，鉴定出PGAM5的K95位点为候选丁酰化位点。免疫共沉淀实验证实，Cys8E NPs处理后丁酰化蛋白组分中PGAM5信号显著增强。功能 rescue 实验表明，将PGAM5的K95突变为精氨酸（K95R）后，Cys8E@CBL NPs诱导的细胞死亡显著减弱，证明PGAM5 K95位点丁酰化是连接Cys8E介导的代谢重塑与坏死性凋亡增强的关键分子事件。
三、研究结论
本研究成功构建了一种GSH响应性Cys8E聚合物纳米平台用于CBL0137的靶向递送。Cys8E@CBL NPs在体内外均表现出优于游离CBL0137的抗肿瘤活性，且未引起明显全身毒性。机制上，该纳米载体不仅通过GSH响应性释放提高了CBL0137的胞内递送效率，还可通过重塑丁酸相关代谢、降低ECHS1丰度、促进PGAM5 K95位点丁酰化，进而增强RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡。这些发现将纳米药物的设计理念从传统的被动载药运输拓展至主动调控代谢依赖的翻译后修饰信号，为开发具有代谢重塑功能的新型响应性纳米抗肿瘤策略提供了重要的理论依据和实验基础。
